The Identification of the Romanovs: Can we (finally) put the controversies to rest?

 

Michael D. Coble, PhD

Formerly, Chief of Research, The Armed Forces DNA Identification Laboratory

 

Летом 2007 года три Российских археолога-любителя обнаружили 44 костных фрагмента и зубы вблизи Старой Коптяковской дороги в Екатеринбурге, Россия. Они были обнаружены приблизительно в 70 метрах от того места, где тридцатью годами раньше были обнаружены останки царя Николая II. В то время я был начальником Исследовательского отдела Лаборатории ДНК – идентификации Вооружённых сил (AFDIL) и находился в отпуске, когда отчёты из России стали хитом новостей. Я думал, маловероятно, что AFDIL  будет предложено исследование этих останков, поскольку сейчас имеется большое количество лабораторий, способных работать с древней ДНК, в отличие от нескольких лабораторий в начале 1990-х, когда были обнаружены первые останки.

Через месяц или немного позже меня пригласил в офис Луи Финелли (директор лабораторий) для обсуждения вероятности участия AFDIL в исследовании этих останков. Пётр Сарандинаки из фонда S.E.A.R.CH. потратил годы своей жизни для поиска пропавших детей Романовых, и он смог убедить Российское руководство,  что AFDIL следует принять участие в этом исследовании.

Окончательное падение царя  Николая II (официально Николай был Императором России) и установление Советской власти изменило ход истории. Я предполагал, что идентификация останков Романовых является также определяющим моментом для судебно-медицинской экспертизы ДНК – даже более решающее, чем первое применение «ДНКотпечатков» с использованием технологии ПДРФД (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) [3,4] для идентификации Колина Пичфорка [5]  Идентификация Романовых стала важным моментом  в развитии,  совершенствовании и применении аутосомных STR–маркеров  и митохондриальной ДНК (мтДНК) в судебно-медицинском исследовании высокодеградированных скелетных останков. 

Несмотря на убедительные результаты, полученные при идентификации семьи Романовых, есть учёные – немногие, но весьма крикливые - попытавшиеся высказывать сомнение по поводу результатов ДНК- анализа. Эти сомнения возможно сыграли роль в принятии решения Русской Православной церкви об отказе признать идентификацию останков в 1998 (6). С обнаружением двух пропавших детей в 2007 году и последующим повторным исследованием первоначального материала первого захоронения, мы можем сейчас ясно представить противоречия, возникшие вокруг обсуждения идентификации Романовых и показать как далеко продвинулась криминалистическая ДНК- идентификация за последние 20 лет.

Летом 2007 года три Российских археолога-любителя обнаружили 44 костных фрагмента и зубы вблизи Старой Коптяковской дороги в Екатеринбурге, Россия. Они были обнаружены приблизительно в 70 метрах от того места, где тридцатью годами раньше были обнаружены останки царя Николая II. В то время я был начальником Исследовательского отдела Лаборатории ДНК – идентификации Вооружённых сил (AFDIL) и находился в отпуске, когда отчёты из России стали хитом новостей. Я думал, маловероятно, что AFDIL  будет предложено исследование этих останков, поскольку сейчас имеется большое количество лабораторий, способных работать с древней ДНК, в отличие от нескольких лабораторий в начале 1990-х, когда были обнаружены первые останки.

Через месяц или немного позже меня пригласил в офис Луи Финелли (директор лабораторий) для обсуждения вероятности участия AFDIL в исследовании этих останков. Пётр Сарандинаки из фонда S.E.A.R.CH. потратил годы своей жизни для поиска пропавших детей Романовых, и он смог убедить Российское руководство,  что AFDIL следует принять участие в этом исследовании.

Окончательное падение царя  Николая II (официально Николай был Императором России) и установление Советской власти изменило ход истории. Я предполагал, что идентификация останков Романовых является также определяющим моментом для судебно-медицинской экспертизы ДНК – даже более решающее, чем первое применение «ДНКотпечатков» с использованием технологии ПДРФД (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) [3,4] для идентификации Колина Пичфорка [5]  Идентификация Романовых стала важным моментом  в развитии,  совершенствовании и применении аутосомных STR–маркеров  и митохондриальной ДНК (мтДНК) в судебно-медицинском исследовании высокодеградированных скелетных останков. 

Несмотря на убедительные результаты, полученные при идентификации семьи Романовых, есть учёные – немногие, но весьма крикливые - попытавшиеся высказывать сомнение по поводу результатов ДНК- анализа. Эти сомнения возможно сыграли роль в принятии решения Русской Православной церкви об отказе признать идентификацию останков в 1998 (6). С обнаружением двух пропавших детей в 2007 году и последующим повторным исследованием первоначального материала первого захоронения, мы можем сейчас ясно представить противоречия, возникшие вокруг обсуждения идентификации Романовых и показать как далеко продвинулась криминалистическая ДНК- идентификация за последние 20 лет.

ДНК исследование первого захоронения.

В середине 1970х Александр Авдонин обнаружил захоронение, в котором находились останки Императорской Семьи и их приближённых (за исключением двух детей - Алексея и Марии). С этим открытием тайна исчезновения Романовых уже не была тайной (7). Однако, только после падения Советского Союза в 1991 году Авдонин и его друг Рябов решили  раскрыть их тайну для всего мира. Проведение анализа ДНК останков было поручено Российскими властями русскому генетику Павлу Иванову и и д-ру Питеру Гиллу из  Forensic Science Service (FSS) в Англии, одному из выдающихся криминалистов-исследователей в области ДНК-идентификации [7]. Д-р Эрика Hagelberg из Кембриджского Университета также была привлечена к исследованию для репликации результатов Гилла и Иванова [8]. 

Подход к ДНК-идентификации, использованный Гиллом и соавт, был основан на использовании аутосомных STR-маркеров и секвенировании двух гипервариабельных участков  мтДНК  (HVI/HVII). STR –маркеры были использованы для идентификации каждого скелета и для того, чтобы показать наличие семейной родственной связи между останками. В то время ДНК- анализ по STR маркерам был на уровне начального развития (младенчества). FSS использовала набор из пяти хорошо зарекомендовавших себя аутосомных STR маркеров – vWA, THO1, F13A1, FES/FPS и ACTBP2 (SE33). Первые четыре из этих маркеров использовали для создания «Квадриплекс» - одного из первых мультиплексов STR- наборов (9).  Каждый маркер был амплифицирован по отдельности со всеми из девяти бедренных костей, обнаруженных в Екатеринбурге (Царь Николай, царица Александра Фёдоровна, три их дочери и четверо слуг). Успешная амплификация с отдельными локусами – а не с мегаплексами из 16 маркеров,  применяемыми сегодня -  была одним из первых свидетельств полезности мини STR - предисловием широкого использования мини STR. За исключением  SE33, локусы, анализированные Гиллом с соавт., давали размер аллелей от  130 до 240 пар нуклеотидов, делая эти маркеры пригодными для анализа деградированной ДНК. Все маркеры были успешно генотипированы, за исключением  SE33 для двух из останков (слуги). Пройдёт ещё несколько лет, прежде чем учёные заново «откроют» ПЦР для маленьких ПЦР-ампликонов для исследования проблемных (сложных) образцов. Необходимо также заметить, что Гилл с соавт. использовали технику повышения чувствительности (увеличение циклов ПЦР-амплификации) для определения STR- генотипа каждого индивидуального образца. Это было необходимо для получения результатов при генотипировании столь сложных образцов.

Полученные STR-профили были использованы для определения останков каждого индивидуума, определения пола и установления родственной связи между членами семьи Романовых. 

Следующим звеном после установления семейной связи останков с помощью анализа STR и митохондриальной ДНК стало установление кровного родства с ныне живущими родственниками царя и царицы по материнской линии наследования. Судебно-медицинский анализ мтДНК, также как и анализ STR-маркеров, только начинал применяться  в начале 1990-х.  Сравнение гаплотипов мтДНК царицы и ее дальнего родственника - кузена Его Высочества принца Филиппа, обнаружило полное совпадение  нуклеотидной последовательности гипервариабельных участков  HVI/HVII. Для царя исследование мтДНК оказалось не столь простым и лёгким. В мтДНК бедренной кости царя Гилл и соавт. обнаружили наличие точковой гиперплазмии С/Т в позиции 16169 и такое «противоречивое» наблюдение потребовало дальнейших исследований.  В середине 1980х гетероплазмия мтДНК относилась к крайне редким или даже несуществующим (10) и по этой причине спорной, вызывающей необходимость дальнейшего исследования. Для подтверждения наличия двух разных последовательностей мтДНК в образце использовали клонирование.  Исследования конца 1980-х  и начала 1990-х, проведенные в семьях пациентов с наследственной оптической нейропатией Лебера [11,12] показали, что гетероплазмия может быть довольно распространенным явлением. Bendall et al.  нашел, что точковая гетероплазмия среди близнецов была действительно широко распространена и высказал предположение, что не выявление её на предыдущей стадии было обусловлено скорее всего ограниченным числом вариантов использованных в те дни реагентов для секвенирования.(13)

Референтные материалы для Николая II – образцы, предоставленные княгиней Ксенией Шереметьевой-Сфири и герцогом Файфом – были гомоплазмидны по позиции 16169 и имели нуклеотид Т в данном положении. Полагая, что такое «исключительно редкое» явление как гетероплазмия у царя вызовет смущение как среди ученых, так и  среди остальной публики, Павел Иванов в личной беседе с д-ром Виктором Уидном, в то время директором AFDIL, во время международного симпозиума по ДНК-идентификации  человека (the “Promega” meeting) обсудил возможность проведения в    AFDIL дополнительных исследований в последующий год. (Павел Иванов и Виктор Уидн, личное общение).

Российские власти разрешили эксгумировать останки брата Николая Георгия для дополнительного исследования мтДНК. Иванов и др. дали ясные и убедительные  доказательства, что точковая гетероплазмия, которую нашли у Николая была в точности такая и у Георгия, хотя и с иным соотношением частоты вариантов [14].

Сейчас мы имеем гораздо больше знаний по мтДНК и имеем прекрасную возможность сравнить гетероплазмию у царя и Георгия и убедиться в том, что гетероплазмия подлинная. Поиск в PubMed по запросу “Human mtDNA Heteroplasmy” показывает, что за последние 23 года опубликовано более 630 статей. Мы знаем теперь, что гетероплазмия  не «редкое состояние» и её легко установить, если используемый метод достаточно чувствителен (15). Гетероплазмия Романова стала хрестоматийным примером гетероплазмии. [16-18].

В дополнение к исследованным Гиллом костным образцам, были тестированы прижизненные образцы Николая II. Ещё будучи юношей, в 1891 г. Николай по распоряжению своего отца  Александра III  совершал путешествие. Во время пребывания в Отцу в Японии, на него было предпринято нападение с саблей. До того как убийцу схватили, Николай получил два скользящих удара с правой стороны головы выше уха. 

Носовой платок, который использовали для остановки кровотечения, был сохранён и в конечном итоге помещён в Японский музей. Во время своего визита в AFDIL в 1995 году Иванов попытался получить чистый генетический профиль из этого материала и надеялся сравнить полученный из материи профиль с ДНК - профилем из скелетированных останков.   Однако попытки получить генотип из материи не имели успеха, и ДНК-профили из этого материала получить не удалось (Павел Иванов, личное общение). 

Попытки опровержения

С завершением научных исследований завершилась идентификация Романовых. Хотя два набора скелетированных останков, принадлежащих Алексею и одной из его сестёр отсутствовали в захоронении, результаты судебно-медицинских исследований идентификации семьи Романовых и их слуг были очень убедительны. К сожалению, это ещё не был конец истории. Не успели ещё высохнуть чернила на двух сообщениях об идентификации  семьи последнего Российского Императора, как «сомневающиеся»  кинулись в атаку. Очень подробный обзор усилий по дискредитации криминалистической ДНК-идентификации, включая понимание политических сил в тот период (которое я не стану здесь рассматривать) было дано в статье Маргариты Нелипы и Хелены Азар [19,20] доступной на сайте: http://www.oocities.org/mushkah/Nagai.html.

Исследования Нагаи

Первым выразил сомнение по результатам идентификации Романовых японский учёный Тацуо Нагаи в 1997 году. Он использовал музейный экспонат - носовой платок после неудачного покушения на Николая II в Японии, хранившийся в музее.  Нагаи заявил, что он получил профиль из этого образца ткани, но этот профиль не совпал с результатами Гилла с соавт. Эта работа никогда не был опубликована в рецензируемых журналах  [19, 20]; однако она стала козырем «сомневающихся», что останки, найденные в Екатеринбурге, были подделкой (фальшивыми). 

В 2008 году две разных Российских лаборатории выполнили ДНК исследование из крови на рубашке, в которую был одет Николай во время нападения на него в Японии (1,21). Полученные полные STR-профили аутосомной и мужской ДНК Николая совпали с генетическими профилями, полученными из скелетных останков Николая II.

В 1999 году совместными усилиями Нагаи и  русского учёного д-ра Вячеслава Попова снова была предпринята попытка опровергнуть экспертизу Романовых путём исследования волос, которые, как предполагалось,  принадлежали Георгию Романову. Нагаи и его коллеги получили 25 волос Георгия и секвенировали их, полученные результаты сравнили с результатами сиквенса мтДНК, установленными Гиллом и соавт.(8). Японские исследователи, основываясь на данных полученного сиквенса, установили, что полученная ими последовательность нуклеотидов не совпадает с последовательностью мтДНК Николая, особенно в позиции 16169, где они нашли только пересмотренную Кембриджскую референтую последовательность (rCRS); [22]) не было никакого намёка на установленную (для Николая) гетероплазмию. Эта статья была опубликована [23], в журнале Igaku to Seibutsugaku на японском языке. Хотя я не знаю японского языка, я прочел часть этой публикации, переведённой на английский м-ром Junichi Hayashi  по просьбе М. Нелипа и Х. Азар для их статьи [19, 20] и которую они любезно мне предоставили. У меня также есть копия этой статьи из U.S. National Library of  Medicine. 

Данные Нагаи с соавт по секвенированию не требуют понимания японского, чтобы их интерпретировать. Эта статья была опубликована [23], в журнале на японском языке Igaku to Seibutsugaku.… Хотя я не знаю японского языка, я прочел часть этой публикации, переведённой на английский м-ром Junichi Hayashi  по просьбе М. Нелипа и Х. Азар для их статьи [19, 20] , и которую они любезно мне предоставили. У меня также есть копия этой статьи из U.S. National Library of Medicine.

Результаты мтДНК, полученные Нагаи были обобщены в табл.1. Ясно видно, что секвенированные образцы волос были контаминированы (загрязнены). В семи позициях имеется смесь двух нуклеотидных оснований: 16169Т/С, 16278 С/Т,  16298Т/С, 16325Т/С, 16327С/Т, 16356Т/С и 16362Т/С. Единственное «отличие», обнаруженное в HVII регионе было в позиции 320С, что соответствует  rCRS. Нагаи и соавт. ошибочно делают вывод, что Иванов и др. наблюдали транзиции в позиции 320 (С-Т). Интерпретировать обобщённые выводы по исследованию Нагаи можно следующим образом: 

(а) мы не нашли гетероплазмию в позиции 16169, 

((b) мы нашли гетероплазмию по 7 другим позициям в образцах волос Георгия Романова, (c) следовательно, мы показали, что существуют сомнения в подлинности останков, найденных в Екатеринбурге.

Более пристальное изучение результатов секвенирования, полученных Нагаи, становится ещё более интересным. Используя программу “Haplogrep” [24], он-лайн- программу для определения гаплогруппы ДНК на основе филогенеза мтДНК относительно филогенетического древа [25], пять из восьми SNPs (16223 C-T; 16298 T/C; 16325 T/C; 16327 C/T;  и 16356 T/C) были ассоциированы с азиатской гаплогруппой (Hg) C1a (табл 1). Оставшиеся три «гетероплазмичных» SNPs (16093 T/C; 16278 C/T; и 16362 T/C) скорее всего индивидуальные мутации, обладателя гаплогруппы  C1a , либо связанные с загрязнением ДНК- матрицы другими индивидуумами. Особенно ставит в тупик, что ни одно из этих отличий по HVII не было отражено в статье [23] Это касается и отсутствия  встречающегося повсюду 263 A-G и 315.1C отличий от rCRS. Принимая во внимание, что очевидна контаминация образцов этих волос образцом индивида с гаплогруппой HgC1a в образце волос, можно ожидать также отличий по позициям  93, 249 (делеция), и 290/291 (двойная делеция) в гипервариабельном участке HVII (Table 1).

В большинстве наиболее опытных судебно-медицинских лабораторий результаты Нагаи с соавт. были бы классифицированы как неприемлемые из-за контаминации, и никаких выводов на основе таких результатов не было бы сделано. Мелтон с соавт  [26] обобщил данные исследования образцов волос по криминальным делам примерно за последние 5 лет и показал, что в старых волосах возможность получить полный профиль уменьшается, но увеличивается шанс обнаружить смешанные образцы. Нагаи с соавт не дают никакого объяснения такому огромному количеству явных «гетероплазмий»  в волосах Георгия Романова [19, 20, 23] – он  только делает  вывод о том, что останки, обнаруженные в Екатеринбурге, царю Николаю II не принадлежат. К сожалению (до сегодняшнего дня) отдельные личности выдвигают доводы Нагаи как  основание для опровержения результатов работ Гилла с соавт [8]  и Иванова с соавт.  [14].

17 июля 1998 года спустя 80 лет со дня казни семьи Романовых, останки, обнаруженные в Екатеринбурге, были захоронены в Петропавловском Соборе в Петербурге. Основываясь на «неопределенности»  результатов анализа ДНК-идентификации, Русская Православная церковь не признала эти останки как принадлежащие семье Романовых.

Исследование Найта.

Второй вызов научным доказательствам идентификации останков Романовых поступил из лаборатории д-ра Алека Найта из Стэнфордского университета. Исследование Найта было опубликовано в рецензируемом журнале Annals of Human Biology [27]. Суть возражений (критики) в работе Найта была основана на результатах исходной идентификации Романовых ранним методом ПЦР ( nested PCR), который использовала группа Гилла для амплификации мтДНК. Гилл и Иванов [8] использовали метод nested PCR, в котором для всего контрольного региона в первой амплификации было применено 30 циклов.  Аликвоты продукта этой амплификации были затем использованы во второй амплификации, которая была нацелена на более короткие ампликоны контрольного участка. 

Группа Найта доказывала, что эта амплификация применяется при относительно больших фрагментах ДНК (≈1200пн) и  что из деградированных образцов, таких как из Екатеринбурга, невозможно получить результаты, полученные Гиллом. Скорее всего, образцы были загрязнены современной ДНК. Группа Найта получила кость пальца, якобы принадлежащая сестре императрицы Александры Фёдоровны Елизавете (также известной как Элла). Элла была замужем за дядей Николая Сергеем, который был убит в 1905 году. После смерти мужа Элла посвятила остаток жизни, помогая беднякам Москвы, будучи монахиней Русской Православной церкви. Она  вместе с несколькими другими родственниками Романова была казнена большевиками на следующий день после казни семьи Романовых в 1918 году.(28). Её тело было обнаружено в деревне вблизи Алапаевска и захоронено Русской Православной церковью в Иерусалиме. 

Используя образец кости Эллы, исследователи утверждали, что они не смогли амплифицировать три длинных фрагмента (437,466 и 1179пн), но ими были успешно амплифицированы два более коротких фрагмента ДНК (108 и 128пн). Такое «отсутствие репликации» для длинных фрагментов ДНК, как утверждала группа Найта, доказывало, что Гилл не смог амплифицировать эндогенную ДНК останков, обнаруженных в Екатеринбурге. Так как современная референтая ДНК образца, использованного Гиллом (его высочество принц Филипп) не соответствовала установленной ими последовательности Эллы, Найт и др. пришли к выводу, что первоначальная идентификация ДНК Романовых является ошибочной. (27)

Так же как Нагаи и Попов, так и Найт с соавт нашли смесь сиквенсов мтДНК. Вместо того, чтобы заявить о незавершённости и неубедительности полученных результатов, Найт провёл дополнительное клонирование, чтобы разделить смесь фрагментов мтДНК. Изучение гаплотипов, полученных при экспериментальных молекулярных клонированиях, определило, что гаплотип «конесенсуной» мтДНК из экспериментов по молекулярному клонированию был аутентичной последовательностью Эллы.(27) Однако подход с использованием «консенсус клонов» не может быть уместным методом для определения подлинной последовательности ДНК, тем более, при судебно-медицинских исследованиях. И если криминалистический образец загрязнён, невозможно знать наверняка  за счёт чего идёт основной компонент: за счёт эндогенной или экзогенной ДНК (является результатом контаминации).

Опровержение исследования Найта было опубликовано в журнале Science [29, 30]. Найт с соавт [31] ответили, перечисляя те же аргументы, которые приводили ранее  [32].

Выводы

И Гилл с соавт, и Иванов с соавт. использовали для оценки весомости доказательств метод  Байеса (Bayesian approach), оценивая достоверность результатов их исследования с точки зрения двух альтернативных гипотез (отношение вероятностей, Likelihood Ratio):

a) Останки принадлежат Романовым

b) Останки не принадлежат Романовым

Статистический анализ данных и Гилла с соавт, и Иванова с соавт был основан на верифицированном контрольном образце, который не вызывал сомнений: его высочество принц Филипп является дальним  родственником   (кузеном) по материнской линии Императрицы Александры Федоровны. Нагаи и Найт не оценивают своих результатов в этом отношении. Вместо этого, каждый исследователь высказывает предположение, что волосы принадлежат Георгию, и что кость принадлежит Элле, без рассмотрения альтернативных гипотез, что эти волосы / костный образец принадлежат  неизвестному индивиду. На самом деле, в своей публикации Найт с соавт предполагают, что если исследованный ими образец действительно соответствует последовательности принца Филиппа, но аутентичная ДНК была просто не определена среди их клонов из-за деградации, тогда бы результаты Гилла вероятно контаминацированы  некой персоной, которая (ну не забавно ли!) просто случайно принадлежит к той же материнской линии, что и принц Филипп!

Во время нашей работы по идентификации Алексея и его сестры (точно сказать какой из сестер, можно обсудить в другое время) двое учёных из судебно-медицинской  лаборатории Екатеринбурга наблюдали и принимали участие в исследовании останков. Наш старательный переводчик Алексей Захарьин был с нами каждый день и являлся «мостиком» для преодоления языкового барьера. Алексей, очень высоконравственный человек, однажды сказал мне, что искренне верит в то, что останки Романовых находились в земле в ожидании, когда придёт время, что русские люди смогут принять случившееся, а наука будет в состоянии идентифицировать тела. Оглядываясь назад, может быть это и к лучшему, что останки двух пропавших детей нашли спустя 30 лет после обнаружения Александром Авдониным первого захоронения. Технический прогресс в судебно-медицинском исследовании ДНК, наконец, дал возможность идентифицировать всю семью Романовых.

Идентификация, повторная идентификация, репликация результатов и подтверждение результатов  мтДНК, аутосомными STR и Y-STR при исследовании останков Романовых заняли около 20 лет. Наши познания в области таких исследований значительно выросли и достигли зрелости с момента проведения первоначальной ДНК-экспертизы останков Романовых. Гилл и др исследователи впервые в судебно-медицинской практике показали полезность применения анализа мтДНК в старом деградированном материале. 

Это исследование заложило основы методологии, гарантирующей качество исследования: суперчистые комнаты, проведение генотипирования персонала, проводящего исследования, и репликация результатов. Это было также первым примером анализа STR-маркеров с использованием увеличенного количества циклов амплификации на ДНК-матрице низкого качества. Исходная работа в 1993-1996 [8, 14]  была водоразделом  для ДНК-идентификации, вопреки некомпетентным попыткам дискредитировать эти исследования с использованием контаминированных образцов, результаты анализа всё-таки выдержали испытание временем благодаря достижениям науки. 

Наступило время  упокоить эти «опровергающие доводы».


Acknowledgements

Я бы хотел поблагодарить некоторых коллег за их полезные комментарии и обсуждение: д-ра Питера Гилла  (University of Oslo), д-ров Кристен Льюис О’Коннор, Джон Батлер, Мэри Саттерфилд и Кэти Шарплесс (NIST), Маргарита Nelipa, Хелен Азар, LTC, Лу Финелли (AFDIL), Пол Стоун (Armed Forces Institute of Pathology) и д-р Манферд Кайзер  (Erasmus University Rotterdam). Я признателен капитану Питеру Сарандинаки  (S.E.A.R.CH Foundation) и Алексю Захарьину за бесконечные часы обсуждения в последние несколько лет русской истории и истории семьи Романовых. Точка зрения, высказанная в данном тексте, принадлежат автору и не представляет официальной позиции U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the Armed Forces Institute of Pathology. Коммерческое оборудование, инструменты и материалы были указаны для того, чтобы определить экспериментальные процедуры так полно, как это возможно. Эта информация не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the Armed Forces Institute of Pathology и не подразумевает, что какие-либо из использованных материалов, инструментов или оборудования непременно являются лучшими среди доступных для данных целей.
 

References

1. Coble MD, Loreille OM, Wadhams MJ, Edson SM, Maynard K, Meyer CE, Niederstätter H, Berger C, Berger B, Falsetti AB, Gill P, Parson W, Finelli LN: Mystery solved: the identification of the two missing Romanov children using DNA analysis. PLoS One 2009, 4:e4838. 

2. Gill P, Kimpton C, Aliston-Greiner R, Sullivan K, Stoneking M, Melton T, Nott J, Barritt S, Roby R, Holland M, Weedn V: Establishing the identity of Anna Anderson Manahan. Nat Genet 1995, 9:9-10, (Erratum in Nat Genet 1995, 9:218.).

3. Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SL: Individual-specific 'fingerprints' of human DNA. Nature 1985, 316:76-79.

4. Gill P, Jeffreys AJ, Werrett DJ: Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature 1985, 318:577-579.

5. Wambaugh J: The Blooding. 1989, William Morrow & Company, New York.

6. Hammer J: Resurrecting the Czar. Smithsonian Magazine 2010 November issue.

7. Massie RK: The Romanovs: the Final Chapter. 1995, Random House Publishing, New York.

8. Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett I, Hagelberg E, Sullivan K: Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet 1994, 6:130-135.

9. Kimpton C, Fisher D, Watson S, Adams M, Urquhart A, Lygo J, Gill P: Evaluation of an automated DNA profiling system employing multiplex amplification of four tetrameric STR loci. Int J Legal Med 1994, 106:302-311.

10. Monnat RJ Jr, Loeb LA: Nucleotide sequence preservation of human mitochondrial DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1985, 82:2895-2899.

11. Holt IJ, Miller DH, Harding AE: Genetic heterogeneity and mitochondrial DNA heteroplasmy in Leber's hereditary optic neuropathy. J Med Genet 1989, 26:739-743.

12. Howell N, Halvorson S, Kubacka I, McCullough DA, Bindoff LA, Turnbull DM: Mitochondrial gene segregation in mammals: is the bottleneck always narrow? Hum Genet 1992, 90:117-120.

13. Bendall KE, Macaulay VA, Baker JR, Sykes BC: Heteroplasmic point mutations in the human mtDNA control region. Am J Hum Genet 1996, 59:1276-1287.

14. Ivanov PL, Wadhams MJ, Roby RK, Holland MM, Weedn VW, Parsons TJ: Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the Grand Duke of Russia Georgij Romanov establishes the authenticity of the remains of Tsar Nicholas II. Nat Genet 1996, 12:417-420.

15. Li M, Schönberg A, Schaefer M, Schroeder R, Nasidze I, Stoneking M: Detecting heteroplasmy from high-throughput sequencing of complete human mitochondrial DNA genomes. Am J Hum Genet 2010, 87:237-249.

16. Watson JD: Recombinant DNA: genes and genomes : a short course (Third Edition). 2007, W.H. Freeman and Company, New York.

17. Butler JM: Fundamentals of Forensic DNA Typing. 2010, Academic Press, Burlington, MA. 

18. Brown TA: Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction (Sixth Edition). 2010, Wiley-Blackwell, Oxford UK.

19. Nelipa M, Azar H: Romanov Imperial Bones Revisited: why does doubt remain about who is buried in the St. Petersburg Fortress? (Part 1). European Royal History J 2006, 9:24-32.

20. Nelipa M, Azar H: Romanov Imperial Bones Revisited: why does doubt remain about who is buried in the St. Petersburg Fortress? (Part 2). European Royal History J 2006, 9:7-11.

21. Rogaev EI, Grigorenko AP, Moliaka YK, Faskhutdinova G, Goltsov A, Lahti A, Hildebrandt C, Kittler EL, Morozova I: Genomic identification in the historical case of the Nicholas II royal family. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106:5258-5263.

22. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N: Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet 1999, 23: 147. 

23. Nagai T, Araki N, Yanagisawa Yuko, Popov VL: DNA identification of Georgij Romanov, a direct brother of the Russian Tsar Nicolas II. Sequence of mitochondrial DNA. Igaku to Seibutsugaku 1999, 139: 247-251.

24. Kloss-Brandstätter A, Pacher D, Schönherr S, Weissensteiner H, Binna R, Specht G, Kronenberg F: HaploGrep: a fast and reliable algorithm for automatic classification of mitochondrial DNA haplogroups. Hum Mutat 2011, 32:25-32. Available at: http://haplogrep.uibk.ac.at/

25. van Oven M, Kayser M: Updated comprehensive phylogenetic tree of global human mitochondrial DNA variation. Hum Mutat 2009, 30:E386-E394. Available at: http://www.phylotree.org.

26. Melton T, Dimick G, Higgins B, Lindstrom L, Nelson K: Forensic mitochondrial DNA analysis of 691 casework hairs. J Forensic Sci 2005, 50:73-80.

27. Knight A, Zhivotovsky LA, Kass DH, Litwin DE, Green LD, White PS, Mountain JL: Molecular, forensic and haplotypic inconsistencies regarding the identity of the Ekaterinburg remains. Ann Hum Biol 2004, 31:129-138.

28. Rappaport H: The Last Days of the Romanovs: Tragedy at Ekaterinburg. 2008, St. Martin’s Press, New York. 

29. Hofreiter M, Loreille O, Ferriola D, Parsons TJ: Ongoing controversy over Romanov remains. Science 2004, 306:407-410.

30. Gill P, Hagelberg E: Ongoing controversy over Romanov remains. Science 2004, 306:407-410.

31. Knight A, Zhivotovsky LA, Kass DH, Litwin DE, Green LD, White PS: Ongoing controversy over Romanov remains. Science 2004, 306:407-410.

32. Zhivotovsky LA: Recognition of the remains of Tsar Nicholas II and his family: a case of premature identification? Ann Hum Biol 1999, 26:569-577.

 
 
  Table 1. Summary of Sequence Data from Nagai et al. [23].

Table 1. Summary of Sequence Data from Nagai et al. [23].

 
n.r. = not reported
1As reported in Table 1 of Nagai et al. [23]
2As reported in Ivanov et al. [14]
*Nagai et al. [23] erroneously reported 320T for the G. Romanov